tembusu病毒（tmuv）是一大群单正链，有包膜。rna病毒。这种病毒通过吸血的节肢动物(蚊子、蜱虫、白飞等)传播而引起感染。在中国，tembusu病毒（tmuv）爆发和传播给我国水禽养殖业带来了巨大损失。本文由江苏农业科学院兽医研究所赵冬敏博士发表frontiers in microbiology杂志发表题目identification of glucose-regulated protein 78 (grp78) as a receptor in bhk-21 cells for duck tembusu virus infection该研究报告了研究论文bhk-21细胞中tmuv结合分子探究。

研究背景

自2010年以来，tembusu病毒（tmuv）严重的鸭病在我国许多省份引起并迅速传播。tembusu病毒属于黄病毒，由三种结构蛋白(包膜[e]，衣壳[c]和膜[m]）它由七种非结构蛋白组成。黄色病毒e蛋白质主要作为受体结合蛋白，是毒性、细胞向性和宿主范围的主要决定因素。黄病毒感染作为包膜病毒的第一步涉及e蛋白质与宿主细胞受体的结合。黄色病毒可以识别单个细胞的表面分子或使用多个受体进入细胞。然后，黄色病毒通过网格蛋白介导的吞咽进入细胞并传递给内体。内体的酸性条件触发e蛋白质介导病毒与内膜的膜融合。最后，形成一个融合孔，将核衣壳释放到细胞溶胶中。近年来，鉴定了多种组合因素，表明黄病毒可以利用多种受体进入细胞，这是菌株特异性和/或细胞类型依赖性。bhk-21细胞中tmuv结合分子还不清楚。

实验方法

1. ip lc-ms/ms病毒与受体结合鉴定

2.?western blot以及免疫荧光检测受体的表达

3.过表达功能实验

结果分析

1.鉴定grp78是tmuv膜蛋白结合

使用病毒覆盖蛋白结合测定参与初步鉴定tmuv结合的bhk-21细胞中的分子。70kda独特的病毒组合条带。tmuv时，tmuv特异性结合带不能单抗检测(图)1a）。通过质谱鉴定，在70kda九种蛋白质是在条带中确定的。八种蛋白质参与细胞代谢和骨架。grp78已被认定为日本脑炎病毒denv作者决定对受体进行研究grp78是否在tmuv与细胞结合起作用。如图1所示，抗性grp78抗体可以特异性识别70kda蛋白质条带进一步证实tmuv和grp78相互作用。

图1 |鉴定grp78是tmuv膜蛋白结合

2.grp78抗体竞争性抑制tmuv进入

bhk-21细胞与针对grp78的n-或c-抗体在末端结构区预孵化，然后进行tmuv感染。在n-末端grp78病毒rna水平显着低于非特异性兔igg细胞的处理，表明n末端grp78抗体可以显著减少病毒的结合。c末端grp78抗体不会影响病毒结合(图2)。

图2 |抗grp78抗体抑制bhk-21细胞中的tmuv感染

3.?grp78在bhk-21细胞表面表达与和谐tmuv共定位

传统上，grp78被认为是内质网腔内蛋白质。最近的研究表明，grp78也表达在细胞表面。grp78在bhk-21细胞表面的表达来自于分离bhk-21细胞膜蛋白和细胞蛋白，并分析蛋白质痕迹。western blot结果显示grp78可在bhk-21细胞表面表达(图3a）。然后观察作者间接免疫荧光测定法grp78和tmuv在bhk-21细胞中的共定位。结果显示grp78与bhk-21细胞表面tmuv共定位（图3b）。

图3 | grp78和tmuv在bhk-21共定位细胞表面

4.bhk-21细胞中grp78的rna干扰抑制tmuv感染

进一步证明grp78在tmuv通过结合和进入细胞的作用shrna降低grp78蛋白在bhk21细胞中的丰度。qrt-pcr表明在bhk-21细胞中grp78的mrna显著抑制水平(图4a）。纯化细胞表面蛋白，分析蛋白质痕迹，显示表面grp78蛋白质丰度降低约70%4b）。与空载体转染的细胞相比，grp78 shrna其转染细胞tmuv rna水平显著降低(约60%)4c）。结果表明grp78在tmuv结合和进入bhk-21在细胞过程中起着重要作用。

图4 |grp78 shrna感染48小时后对tmuv进入的影响

5.bhk-21在细胞中表达grp78会提高tmuv感染

然后作者发现了表达grp78在细胞中，它tmuv rna水平显著提高(图5)。通过敲低和表达功能实验证明grp78蛋白支持tmuv进入bhk-21细胞。

图5?|grp78表达48小时后对tmuv进入的影响

实验结论

本文首次鉴定grp78是bhk-21细胞感染tmuv时的受体。grp78参与tmuv结合并进入受体bhk-21细胞在病毒感染中起着重要作用。grp78可以更好更好的了解tmuv发病机制。grp78对tmuv感染的多重关键作用可能为抗病毒药物的设计提供新的目标和相关的目标tmuv其他预防和控制的信息。

tembusu病毒（tmuv）爆发和传播给我国水禽养殖业带来了巨大损失。在本文的研究中，作者利用蛋白质组的学质谱鉴定技术来确定grp78蛋白是鸭tmuv感染的bhk-21细胞中的受体。这篇文章首先来自bhk-21细胞膜通过病毒覆盖蛋白结合试验（vopba）观察到约70kda的tmuv结合蛋白质。免疫共沉淀结合lc-ms/ms鉴定grp78为与tmuv相互作用的蛋白质。grp78抗体可抑制tmuv与bhk-21细胞表面的组合。间接免疫荧光显示grp78与tmuv在细胞表面共定位。此外，功能实验表明降低/过表达grp78抑制/增加tmuv感染。这些结果表明grp78是参与tmuv新宿主因素。本文通过蛋白质组学质谱技术鉴定病毒与受体相结合的思路值得借鉴。上海鹿明生物科技有限公司协助完成蛋白质鉴定。

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